Als ordnendes Gefüge der Ausstellung dienen die politischen Ereignisse um die Familie der Medici, die maßgeblichen Einfluss auf die Entwicklung der Kunst ihrer Zeit nahm. So ist als Ausgangspunkt das Jahr 1512 gewählt, als die Medici nach Florenz zurückkehrten und ihre alte Machtstellung zurückerlangten. Der weitere Verlauf der Ausstellung gliedert sich nach den historischen Entwicklungen in Florenz und Rom, und findet seinen Endpunkt im Jahr 1568, als die Künstlerviten Vasaris publiziert wurden und den Grundstein für die historische Betrachtung der künstlerischen Epoche des Manierismus legten. Giorgio Vasari bildet auch als Maler und später Vertreter des Manierismus den Schlusspunkt der Ausstellung, da seine Werke im letzten Saal versammelt sind.
Innerhalb dieses Rundganges finden sich verschiedene thematische Schwerpunkte. So widmet sich beispielsweise ein Saal dem monumentalen repräsentativen Damenporträt, das besonders Bronzino in seiner Eigenschaft als Hofmaler der Medici prägte. Den Mittelpunkt bildet die
Dame in Rot, die um das ebenso beeindruckende Porträt einer
Dame in Grün, um 1530-32, ergänzt wird. Die souveräne Eleganz und die höfische Pracht, mit der Bronzino die Damen in malerischer Virtuosität verewigte, lassen erahnen, weshalb der Manierismus gerne auch als „the stylish style“ bezeichnet wird.
Einen weiteren thematischen Schwerpunkt bildet der Paragone – der Wettstreit der Kunstgattungen. Dieser wurde im Florenz des 16. Jahrhunderts intensiv geführt und erweckte das Bestreben der Künstler, sich in Malerei und Plastik gegenseitig zu überbieten. Es sind daher Kleinplastiken hochberühmter florentiner Bildhauer zu sehen, etwa von Giambologna oder Benvenuto Cellini. In diesen Werken werden zum einen die Bezüge zu Antike und Hochrenaissance ins Gedächtnis gerufen, was in einer bronzenen Replik der Laokoongruppe von Jacopo Sansovino aus dem Jahr 1507 besonders deutlich wird. Zum anderen werden aber vor allem die engen Bezüge zwischen Malerei und Plastik in zahlreichen Beispielen anschaulich gemacht.
Einen weiteren Seitenblick – in die Kunstgattung Architektur – bietet ein imposantes Modell vom Treppenhaus der Biblioteca Laurenziana Michelangelos, das den Besucher im zweiten Teil der Ausstellung in Empfang nimmt.